Elektroforese er en laboratorieteknikk som elektrisk separerer molekyler basert på elektrisk ladning, størrelse og form. Separasjonen kan brukes til å identifisere molekyler og organismer. Elektroforese blir ofte brukt på biomolekyler som peptider, proteiner og nukleinsyrer (DNA og RNA).
Teknikken baserer seg på bevegelse av elektrisk ladde molekyler i et elektrisk felt.
Elektroforese brukes innen biokjemi, medisin og molekylærbiologi, både til analyse og til isolering av enkeltkomponenter i blandingene. Analysemetodene kan brukes til å påvise et protein i en prøve eller et gen i en prøve. I tillegg kan elektroforese brukes til artsbestemmelse av de fleste organismer gjennom Sanger-sekvensering, hvor elektroforese er en sentral del av metoden. En praktisk bruk av isolering gjennom elektroforese er å isolere et spesifikt gen som deretter kan bli satt inn i en annen organisme (danne GMO) for forskning eller industriell produksjon.
Elektroforese kan brukes på flere måter i medisin for diagnostikk. Enkelte sykdommer fører til spesifikke proteiner i blod og andre kroppsvæsker. Disse proteinene kan påvises gjennom elektroforese og dermed påvise sykdom. En annen applikasjon er ved infeksjon der Sanger-sekvensering gir muligheten til å bestemme hvilken bakterieart som forårsaker infeksjonen, eller å identifisere gener for produksjon av toksiner i en prøve.
Elektroforese av proteiner gir forskjellig mønstre for forskjellige dyre- og plantearter, også for individer i samme art. Dette brukes i landbruksforskningen til identifikasjon og beskrivelse av planter, og i næringsmiddelkontrollen for å bestemme hvilken dyreart kjøttet kommer fra. I biologisk taksonomi (biologisk systematikk) brukes elektroforese som et ledd i å bestemme slektskapet mellom arter.
Serumelektroforese er når man gjør elektroforese på proteinene i blodserum. Resultatet kan se ut omtrent som dette. Den horisontale aksen viser avstanden mellom den positive og den negative elektroden. Proteinenes vandring starter ved den negative siden og vandrer mot den positive. Arealet under den røde kurven viser hvor mye protein som er til stede. I illustrasjonen er alfa-1 (α1) og -2 (α2), beta (β) og gamma (γ) markert. Prealbumin ligger foran albumin i et elektroforesemønsteret og vises ikke i figuren.
Det finnes flere ulike former for elektroforese. Felles for dem er at analysen foregår i et kar med en elektrode i hver ende. I den ene enden er elektroden negativt ladd (minus-pol) og i den andre enden er det positiv ladning (pluss-pol). Karet inneholder ofte vann som er gjort strømledende ved at det inneholder løste elektrolytter, kjent som en buffer-løsning.
I de fleste elektroforeseteknikker brukes et porøst medium til løsningen, vanligvis en gel. Ofte er gelen en tynn rektangulær skive der flere prøver kan settes av ved siden av hverandre, slik at de kan sammenlignes. Forbindelsene som skal separeres, er som regel for små til å kunne ses med det blotte øyet, og de må derfor farges eller merkes radioaktivt. På den måten kan mengder på mindre enn en milliondels gram (mikrogram) påvises.
Siden molekylene som skal analyseres har en elektrisk ladning, vil de bevege seg i en bestemt retning når det sendes elektrisk strøm gjennom karet: Positivt ladde partikler vandrer mot den negative polen, og negativt ladde partikler vandrer mot den positive polen.
Hvis strømmen er konstant, beveger hver partikkel seg med en egen konstant hastighet. Hastigheten bestemmes av partiklenes ladning, form og størrelse, feltstyrken og løsningens viskositet. Forskjellige partikler vandrer derfor med ulik hastighet og kan skilles fra hverandre basert på hvor langt i feltet de har beveget seg. Slik fungerer elektroforese som et verktøy for separasjon av molekyler og andre partikler i sammensatte blandinger. Molekylene kan identifiseres ved at det tilsettes standarder med kjent størrelse. Disse standardene inneholder komponenter som vil bevege seg med en kjent hastighet, slik at molekylene i prøven kan sammenlignes med disse. Slike standarder må tilsettes i hver enkelt analyse for at resultatet skal være gyldig.
1) For å støpe en gel til elektroforese heller man agarose i et kar. Øverst plasseres en kam. 2) Når gelen er størknet, tar man ut kammen, som etterlater brønner. 3) Brønnene fylles med prøvemateriale. Brønnen til venstre fylles med et kjent materiale som man kjenner hastigheten til. 4) Man setter spenning på gelen. 5) Etter noe tid har prøvene vandret nedover gelen og danner ulike bånd. 6) Båndene i brønn 2 og 3 avleses mot båndene i den kjente «DNA-stigen».
Den vanligste teknikken er elektroforese i en gel i et konstant elektrisk felt. Dette brukes blant annet i analyse av nukleinsyrer (DNA). I porøse geler med små porer skilles DNA-fragmenter svært godt etter størrelse. Ved å behandle DNA-et med etidiumbromid (eller et tryggere alternativ) og eksponere gelen for UV-lys, så vil man kunne se DNA-båndene med det blotte øye.
Pulsfeltelektroforese er elektroforese i gel der molekylene periodisk blir tvunget til å forandre retning, brukes blant annet til å kartlegge menneskets kromosomer.
SDS-elektroforese brukes til å bestemme molekylvekten til proteiner. Her utføres elektroforesen i gelmediet med negativt ladde såpemolekyler (SDS) som bindes til proteinene og gir dem en enhetlig ladning, slik at det bare er størrelsen som bestemmer vandringshastigheten. Denne metoden kan også brukes til å skille ikke-vannløselige proteiner. Gelmediet består vanligvis av polyakrylamid.
Todimensjonal gelelektroforese er en teknikk der to prosesser kombineres. For eksempel kan isoelektrisk fokusering brukes i den ene retningen og soneelektroforese vinkelrett på den første retningen. Denne metoden brukes blant annet innen cellebiologi for å kartlegge blandinger av proteiner og peptider i celler. Den kombineres ofte med MALDI-massespektrometri for identifisering av de separerte proteinene
Aminosyrer og proteiner har både positive og negative ladninger, men alle vil ha en pH der molekylet totalt sett er elektrisk nøytralt, det vil si at de har like mange positive og negative ladninger i molekylet.
Isoelektrisk fokusering er en elektroforesemetode som utføres med en pH-gradient i det elektriske feltet. Et protein eller en aminosyre vil bevege seg i elektroforesen til de når det området som har pH der de er nøytrale, det isoelektriske punktet.
Kapillærelektroforese er en teknikk som brukes for å analysere spormengder av blant annet aminosyrer og fettsyrer, men også til sanger-sekvensering. Teknikken bruker små, tynne kapillarrør av kvarts som kan enten være fylt av buffer-løsning eller en gel.
Sanger-sekvensering bruker kapillærelektroforese med en gel for å skille DNA-fragmenter. Dette kan bestemme sekvensen av et kort DNA-fragment (opptil 1000 basepar). Det er også mulig å ha en pH-gradient i kapillarrøret og dermed gjennomføre isoelektrisk fokusering.
Kommentarer
Kommentarer til artikkelen blir synlig for alle. Ikke skriv inn sensitive opplysninger, for eksempel helseopplysninger. Fagansvarlig eller redaktør svarer når de kan. Det kan ta tid før du får svar.
Du må være logget inn for å kommentere.